目的 研究银杏内酯（ginkgolides，Gin）对神经生长因子（nerve growth factor，NGF）诱导分化的嗜铬细胞瘤（PC12）细胞的影响以及与其相关的信号通路。方法 通过MTT比色法观察不同浓度Gin对PC12细胞活性的影响，RT-PCR和Western Blot法分析Gin对PC12细胞低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表达以及MAPK信号通路的影响。结果 一定浓度范围的Gin可促进PC12细胞的活性，在37．5mg·L^-1作用24h效果最明显。37．5mg·L^-1Gin单独处理PC12细胞24h可诱导HIE-1α mRNA表达增强和蛋白水平上调。Gin还引起p-ERK水平的明显提高。Gin增加PC12细胞HIF-1α蛋白的稳定性存在一定的时间和剂量依赖关系，PD98059可部分抑制Gin的增强作用，金雀异黄素可完全阻断之；与此相对应的是，Gin以时间和剂量依赖方式诱导PC12细胞p-ERK水平的增高，PD98059和金雀异黄素均能完全阻断Gin的诱导作用。结论 Gin可诱导PC12细胞表达HIF-1α．主要与MEK-ERK信号通路激活有关，可能是其促进分化的PC12生长的原因。

 关键词:银杏内酯 低氧诱导因子-1α 嗜铬细胞瘤细胞 磷酸化细胞外信号调节激酶

 低氧诱导因子(hypoxia-indueible factor．1，HIF-1) 是缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体内的一种 转录因子，能激活许多缺氧反应基因(hypoxia—re— sponse gene，陬G)如促红细胞生成素(EPO)，血管内 皮生长因子(ⅦGF)的表达，是哺乳动物和人在缺氧 条件下维持氧稳态的关键性物质。HIF-1是一种异 源二聚体转录因子，主要由两个亚单位HIF一1a和 HIF-I~组成，都具有basic Helix—Loop—Helix(bHLH)结 构的碱性蛋白，其中缺氧可使HIF-la在细胞核中积 聚。正常氧分压环境中细胞HIF-1蛋白的a亚基通过蛋白一蛋白酶系统迅速降解，在胞浆中几乎检测不 到l卜 。进一步的研究发现，HIF一1也可被多种胞外 刺激活化，上调影响细胞存活、生长、分化、以及凋亡 的基因表达，具有重要的生理病理作用。目前比较 常用的HIF一1化学诱导剂是二价金属离子(如co— CI2)和铁螯合剂(如desferrioxamine，DFO)，它们的作 用机制不完全相同。

 银杏内酯(ginkgolide，Gin)是银杏叶提取物的主 要活性成分之一，已分离出Gi以，B，c，M，J，其中 GinB是一种强血小板活化因子(platelet—activatinfactor，PAF)受体拮抗剂。本项目的前期工作表明， Gin在终质量浓度为37．5 mg·L 时，对原代培养的 皮层神经元有较好的促生长作用，且在一定程度上 可抵抗兴奋性氨基酸毒性、羟自由基等损伤，对模拟 高原缺氧性损伤也有较好的保护作用_4 j。本研究 在检测Gin对诱导分化后嗜铬细胞瘤(PC12)细胞生 长影响的基础上，观察了Gin对PC12细胞HIF—la表 达的影响，并探讨了影响HIF—la表达的信号通路。

 1 材料和方法

 1．1 主要试剂和仪器

 大鼠。肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株(武汉典型培养 物保存中心)；Gin(中国药科大学天然药物化学教研 室，批号950105，总内酯含量95．35％，为白色粉末)； mNGF 2．5 S(Alomone Labs，USA)；RPMI1640培养 基、DMEM培养基、马血清、逆转录试剂盒、Trizol Reagent(Gibeo公司)；L一多聚赖氨酸、胰蛋白酶、C0一 cl2、抗~aetin单克隆抗体、金雀异黄素(genistein， Sigma公司)；PD98059(CaIbiochem公司)；dATP， dqq’P,dCTP，dGTP(Promega公司)；Taq DNA poly— merase(上海生工生物技术工程有限公司)；抗HIF-lc~ 单克隆抗体(Novus Biologieals公司)；Anti—phosphory— lated ERK1／2多克隆抗体和Anti—total ERK1／2多克 隆抗体(Cell Signal公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标 记的羊抗鼠IgG(北京中山生物技术有限公司)；C02 细胞培养箱(Series 5400，NAPCO)；电泳和蛋白转膜 设备(Bio—Rad公司)；PCR仪(1VlJ Research公司)；全 自动酶标仪(Elx800，Biotek)。

 1．2 PC12细胞培养

 PC12细胞用含5％胎牛血清、10％马血清的 RPMI1640完全培养基在以多聚赖氨酸包被过的培 养瓶中培养，置于5％ C02、饱和湿度、37℃培养箱 内，每隔3～4 d换液1次。分组实验时取培养的 PC12细胞，用吸管吹打使其悬浮并成单个细胞， 1 000 r·min 离心5 min，弃上清，加入DMEM基础 培养基洗涤2次。最后将沉淀重悬于含3％胎牛血 清、3％马血清的DMEM培养基中，以每1 mL含1× lO6个细胞密度的细胞悬液接种于预先用多聚赖氨 酸包被的96孑L培养板中，每孑L 100 用于MTr测 定；接种于6孑L板中，每孑L 2 mL，用于提取蛋白进行 Western blot分析。接种时加入NGF诱导，终质量浓 度为O．05 mg·L～。倒置显微镜下观察细胞分化的 形态改变。NGF诱导7 d后用于实验。

 1．3 药物处理

 Gin，PD98059和金雀异黄素均经DMSO彻底溶解后再溶于DMEM 培养基，DMSO的终浓度为 0．1％，对照组加入同样浓度的DMSO溶液。

 1．4 MTr法检测细胞生长

 取96孑L培养板，各组细胞经药物处理24 h后 用PBS洗2遍，每孑L加入MrI1’(5 g·L )溶液25 ， 37℃孵育4 h，然后每孑L加入20％SDS溶液100 ， 37℃孵育24 h，用全自动酶标仪于570 nln波长测吸 光度( )，每组均设8个复孑L，实验重复2次以上。

 1．5 全细胞提取液的制备

 各组细胞移去培养基，用预冷的PBS洗2遍，置 于冰台上，在PBS中用细胞刮刮取孑L中贴壁生长的 PC12细胞，分别收集于相应的1．5 mL微量离心管 中，1 000 r·min 离心5 min，弃上清，于沉淀中加入 200 裂解液[10 mmol·L～Tris—HCI，1．5 mmol·L MgCl2，10 mmol·L～KC1，2 mmol·L 二硫苏糖醇 (DTr)，O．4 mmol·L 苯甲磺酰氟(PMSF)，2 mg· L 抑肽酶(aprotinin)，2 mg·L 亮肽素(1eupeptin)， 2 mg·L 胃酶抑素(pepstain)，pH 7．6]，冰水浴裂解 30 min，以10 000 r·min 离心5 min，上清液为细胞 提取液。改良的Lowry法测定蛋白含量、分装，一7O ℃冻存。

 1．6 蛋白质免疫印迹

 采用SDS—PAGE不连续电泳系统进行垂直板电 泳，每孑L上样60 蛋白。浓缩胶(5％)电压为100 v，分离胶(10％)电压为150 V，直至溴酚蓝抵达分 离胶底部后20 min，断开电源。采用全湿法(BIO— RAD电泳仪)稳流350 mA，2 h左右将分离胶上的 蛋白条带转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的TBS 包被2 h，浸入加有一抗(抗HIF—la单克隆抗体1： 200稀释，抗磷酸化ERK1／2多克隆抗体1：200稀 释，抗~aetin单克隆抗体1：4 000稀释，抗总ERK1／ 2多克隆抗体1：200稀释)的新鲜配制的封闭液中，4 ℃过夜。次日，加入溶于封闭液中的二抗rmr,-igc (1：300稀释)室温2 h。将ECL中试剂A和B各吸 出O．5 mL，混匀后将膜浸入2 min，于压片盒中x光 片曝光。

 1．7 RT．PCR

 NGF诱导7 d后的PC12细胞改用DMEM无血 清培养24 h，Trizol试剂提取总RNA。按基因公司逆 转录试剂盒操作步骤逆转录反应合成cDNA，在O．5 ⅡlL微量离心管中依次加入总RNA 3 ，2 tmaol·L Oligo dT(12～18)1 ，补充适量DEPC一水，使总体积 达1O ，轻轻摇匀离心。65 ocjjn热5 min，插入冰浴 中至少1 min，然后加10×PCR bufer 2 ，25 mmol·

 L MgC12 2 ，10 mmol·L dNTPs 2 ，0．1 mol· L DTY 1 ，轻轻混匀，离心，42℃孵育2 min。加 入superscript11(鼠源性逆转录酶突变体)1 ，42 ℃孵育50 min。70℃加热15 min，以终止反应。将 微量离心管插入冰中加入RnaseH 1 ，37℃孵育 20 min，降解残余的RNA，分装，一20℃保存备用。 PCR扩增HIF-la基因：取O．5 mL微量离心管，依次 加入下列成分：10×PCR缓冲液5止，10 twaol·L dNTPs 1 L，10 tmaol·L一 primer-upstream 1 L，10 gmol·L— primer-downstream 1 l上L，TaqDNA酶5 U、 HIFla cDNA第一链2 ，双蒸水加至5O 。将上 述混合物轻轻混匀，稍加离心。反应程序如下：94 ℃预变性5 min；94℃ ，45 s；55 oC，40 s；72℃，45 s； 进行3O个循环。72℃延伸7 min。每管在第9次循 环后，加入GAPDH引物，同时扩增GAPDH基因。 1％ 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。四星图像处理 系统测定扩增带曲线下的吸光度值(A)，计算HIF． 1a和GAPDH带吸光度值的比值(A／A0)。根据 GenBank提供的资料设计HIF．1a和GAPDH的引物， 并经GenBank BLAST进行同源性检索后，由上海生 工生物技术工程有限公司合成。引物序列如下： HIF．1a弓I物(1eft 5 CCCA u I3ACA ATAC℃ GC 3 ； right 5 (：TGCC ’GTA1’G( AGCA1Tr 3 ；预计扩增片段 长度306 bp)。GAPDH引物(kff 5 ACCACAGTCCAT． GCCATCAC 3 ；right 5 TCCACCACCC 111GCTGTA 3 ； 预计扩增片段长度452 bp)。

 1．8 统计学处理

 结果用均值±标准差表示。Smm6．0统计软件， 组间结果采用单因素方差分析和Q检验(Newman． Keuls法)来比较其差异。

 2 结果

 2．1 不同浓度Gin对PC12细胞活性的影响

 用MTY法检测PC12细胞的活性，发现在 9．38～37．5 n1g·L 内，Gin对经NGF诱导分化的PC12 细胞有促进生长作用，且存在一定的剂量依赖关系， 当质量浓度增加至37．5 n1g·L 时促生长作用最明显 (P<0．01)，以后随之减弱。当质量浓度增加至150 n1g·L 时，PC12细胞的活性低于正常水平。利用不 同质量浓度组MTY检测所得A570 值的均数(y)和 Gin的终质量浓度(J0)建立方程式如下：

 Y=0．6+0．2l7 9×exp[一0．5×(p一40．53) ／33．84

 对方程进行F检验得P<0．05，故认为此回归 方程有意义，调整r =0．988 4。Y的估计值对J0作 拟合曲线见图1。

 图1 不同浓度Gin对PC12细胞活性影响．n=8，牙±s Fig 1 Efects of Gin at diferent concentration on the viability of PC12 cells．n=8．牙±s

 2．2 Gin可诱导PC12细胞H]~’-lct mRNA和蛋白表达

 PC12细胞RT．PCR扩增产物的电泳结果见图 2A，PC12细胞在常氧条件下几乎不表达HIF．1a mR— NA蛋白，PC12细胞在Gin(37．5 mg·L )处理24 h 后HIF-la mRNA表达明显增加，以HIF—la和GAPDH 条带光吸光度值的比值(A／A0)表示HIF-la mRNA 的相对含量，3次独立的实验结果经图像分析系统 灰度扫描后进行统计学分析(图2B)。Western blot 技术检测常氧条件下PC12细胞很少表达HIF．1a， Gin(37．5 rng·L )处理24 h后HIF-1a蛋白表达显著 提高(图2c)，用四星图像分析仪，Shine Tech Gel Analysis软件分析，以HIF．1a／13．actin条带灰度扫描 比值表示HIF．1a蛋白水平的相对含量。3次独立实 验的统计学分析结果见图2D。

 图2 Gin诱导HIF．1a mRNA和蛋白表达

 A—RT-PCR电泳典型图，其中：1一标准分子量，2一对照组，3一PC12细胞经 Gin(37．5 nag·L一1)作用24 h；B—RT-PCR电泳3次独立实验的直方图( )P< 0．0l，与对照相比)；C—Western Blot实验典型图，其中：1一对照组，2一PC12细 胞经Gin(37．5mg·L一1)作用24 h；D一3次Western Blot实验的直方图(1)P< 0．0l，与对照组相比)

 Fig 2 Expression of H -1a mRNA and protein induced by Gin in PC12 cells

 A—RT-PCR electwphoretic pieture．1一marker，2一control，3一PC12 cells with Gin (37．5mg·L一 )trealmentfor 24 h；B—RT-W,R results are essed(1)P<0．0l，vs control，n=3)；C—Western Blot picture，1一control；2一PC12 ceils with Gin(37．5 mg·L一 )a’eam~entfor24 h；D—WesternBlot results are essed( )P<0．0l，vs con． tro1．n=3)

 2．3 Gin诱导PC12细胞HIF．1a表达随作用时间延 长而增强且可被PD98059和金雀异黄素阻断

 笔者分别观察了37．5婵·LI1 Gin作用不同时 间对PC12细胞表达HIF．1a的影响。Gin作用24 h 引起HIF．1a表达增高最为明显，随时间的减少也逐 渐减弱，2 h仍比对照组明显增加(图3条带1至4)。 浓度分别为9．37，18．75 mg·L 的Gin作用24 h，也 能诱导PC12细胞HIF．1a蛋白表达稳定性增加，但 明显小于37．5 rI1g·L Gin的作用(图3条带7，8分 别与1相比)。150 tnnol·L 金雀异黄素作用1 h完 全抑制了HIF．1a的表达(图3条带5与1相比)，100 gmol·L PD98059作用1 h则部分抑制Gin的诱导 作用(图3条带6与l相比)，结果见图3。

 图3 Gin以时间和剂量依赖方式诱导PC12细胞HIF-la蛋 白稳定性增高

 1—37．5 nag·L一 Gin作用24 h；2—37．5 nag·L一 Gin作用12 h；3—37．5 nag·L一 Gin作用2 h；4一对照组；5—150 tnnol·L一 金雀异黄素作用1 h后37．5 nag· L Gin作用24 h；6—1130tnnol·L一 PD98059作用1 h后37．5 mg。L一 Gin作用 24 h；7—9．37 nag·L一 Gin作用24 h；8—18．75 nag·L一 G_m作用24 h

 rig 3 Stability of HIF-la expression of PC12 ceHs enhanced by Gin in a time-and dose-dependent nlanne

 1—37．5 mg·L—l Gin treated for 24 h：2—37．5 mg·L—l Gin treated for 12 h；3— 37．5mg·L—l Gin treated for 2 h：4一control；5—150tmlol·L—l Genistein treatedfor l h before 37．5mg·L—l Gin treatedfor 24 h：6一l00tanol·L—l PD98059forl hbefore 37．5 mg·L—l Gin treatedfor 24 h：7—9． 37 mg·L—l Gin treated for 24 h；8— 18．75 mg·L—l Gintreatedfor24 h

 2．4 Gin诱导PC12细胞p42／p44MAP~信号通路激活

 与上述结果相类似的是，37．5 mg·L Gin作用 2 h引起p-ERK水平略有增高，随时间延长继续增 高，24 h最为明显(图4条带1至4)。与对照组相 比，9．37 mg·LI1的Gin对p-ERK水平无明显影响， 18．75 mg·L 的Gin作用24 h，才使p．ERK水平有所 增加，但明显小于37．5 mg·L (图4条带7，8)。150 tunol·L 金雀异黄素和100 tnnol·L PD98059分别 作用1 h均完全抑制Gin的诱导作用，p-ERK几乎没 有表达。

 3 讨论

 近年的研究表明，除了低氧，一些营养因子和化 学试剂也可诱导HIF．1a的表达l6j。本研究显示， Gin对经NGF诱导分化的PC12细胞生长有显著的 促进作用，且在9．38—37．5 mg·L 内存在明显的剂 量依赖关系，在质量浓度为37．5 Inf；·L 时显示最明 显的作用。由于NGF诱导分化后的PC12细胞不再

 图4 Gin以时间和剂量依赖方式诱导PC12细胞p-ERK激活

 1—37．5mg。L一 Gin作用24 h；2—37．5mg·L一 Gin作用12 h；3—37．5 nag·L一 G_m作用2 h；4一对照组；5一l50tmlol。L一 金雀异黄素作用1 h后37．5 mg· L一 Gin作用24 h；6一l0otmlol·L一 PD98059作用1 h后37．5mg·L一 Gin作用 24 h；7—9．37 mg·L一 Gin作用24 h；8—18．75 mg·L一 Gin作用24 h rig 4 Expression of phosphorylation of ERK(p-ERK)of PC12 ceHs induced by Gin in a time-and dose-dependent manner 1—37．5 mg·L—l Gin treated for24 h；2—37．5 mg·L—l Gin treated f0r 12 h：3— 37．5 mg·L—l Gin treatedfor2 h：4一control；5—150tnnol·L—l gemsmin treatedfor1 hbefore 37．5mg·L lGin treatedfor24 h：6一l0otmlol·L—l PD98059treated 1 h before 37．5 rag‘L—l Gin treated for 24 h；7—9． 37 mg·L—l Gin treau~d for 24 h； 8—18．75mg。L—l G．m treatedfor24 h

 分裂，显示神经元的诸多特征，该结果进一步证明了 Gin对神经元的促生长和保护作用。

 Gin还可诱导HIF—la mRNA表达和蛋白水平的 明显增高，在质量浓度为37．5 rI1g·L～，时间为24 h 时蛋白水平增高最为明显，提示Gin有可能促进了 HIF_1a的合成。已知MAPK信号通路中p-ERK的激 活通常与细胞的生长相关，且有研究表明，p-ERK的 激活可增加HIF．1a的表达、稳定性及转录水平，说 明H1F．1的刺激活化，与细胞生长之间存在一定的 关系。本研究则首次发现，Gin诱导的HIF．1et水平 增高与p．ERK的激活相伴随，用酪氨酸激酶抑制剂 金雀异黄素不仅可完全阻断p-ERK的激活，同时也 完全抑制HIF．1a的稳定表达；MEK1／2的专一性阻 断剂PD98059，则部分抑制了HIF．1a的稳定性表达。 该结果说明，Gin对神经元的促生长作用与激活 HIF．1有一定关系 j。

 由于HIF．1a蛋白在常氧条件下极容易被泛素蛋 白酶水解，Gin诱导HIF．1a蛋白水平增高也不排除与 抑制HIF．1a的水解有关，关于这一点还需要做进一 步证明。从本研究的结果来看，Gin至少可以通过增 加HIF．1a mRNA表达来增加蛋白的合成，且Gin可以 通过激活p．ERK途径参与诱导HIF．1d表达。